COVID-19 病毒是一种 β 属冠状病毒，在基因序列上与 SARS-CoV 具有79.5%的相似度，故其蛋白结构也与 SARS-CoV 蛋白类似。青岛海洋科学与技术试点国家实验室的科研团队采用 Swiss-Model 同源模建方法，成功构建了 COVID-19 病毒的 Spike- RBD、ACE2、Mpro (3CLpro)、PLpro、nsp16、X结构域、RdRp (nsp12) 共7个蛋白或者结构域的三维结构。这些蛋白结构的模建为靶向 COVID-19 病毒关键蛋白进行虚拟筛选提供了充足的信息。
 

01活性位点的选择

7个靶标蛋白的结构信息均采用青岛海洋科学与技术试点国家实验室的科研团队经过力场限制性优化后的复合物结构。我们选用了 Mpro、PLpro、nsp16、X结构域和RdRp 各自的活性位点（或底物/配体结合域）作为虚拟筛选过程中的小分子抑制剂的结合口袋。而根据文献，Spike-RBD 的受体蛋白是 ACE2，二者相互作用的交界面已经成为阻断 COVID-19 病毒感染的重要靶点。鉴于RBD和ACE2的作用界面较大（图1A），我们详细分析了二者相互作用的热点氨基酸残基（图1B）并利用 Sybyl-X2.0 的 Surflex 的 “Protomol Generation” 模块成功确定了一个有潜力的成药口袋（图1C）。经分析，RBD 和 ACE2 之间共形成了13条氢键相互作用。该抑制剂结合口袋由 RBD 的L452，L455，F456，T470，E484，Y489，F490，P491，L492，Q493，S494 等为主的氨基酸残基构成（图1C）。

图1. (A) COVID-19病毒的Spike蛋白的RBD与ACE2相互作用的表面结构图;(B) 两蛋白互作的热点区域（红色虚线）;(C) 预测的Spike蛋白的RBD的成药口袋 ;(D) Spike蛋白的RBD与虚拟筛选出的代表化合物G721_0034的结合模式图。

 

02虚拟筛选

第一轮使用 Surflex 模块进行筛选，为提高筛选效率，将 "Max conformations per Fragment" 从默认的20降为10，将 "Max number of rotatable bonds per molecule" 从默认的100降为50。取消 "Per-Dock Minimization" 和 "Post-Dock Minimization" 的选项。筛选出分子打分数值在top 500的小分子化合物。继续采用Surflex模块进行第二轮筛选，设置为默认参数，最终选取对接打分top 100用于人工筛选。

图2. COVID-19 病毒关键靶标蛋白与虚拟筛选出的代表性化合物的结合模式图(A) Mpro-BS181 ;(B) PLpro-G395_1671; (C) X结构域-Lithospermic_acid_B; (D) ACE2-G395_1665; (E) RdRp-Methyl_lithospermate_B; (F) nsp16-Methyl_lithospermate_B
 

03人工筛选

人工筛选的过程中，我们综合考虑了：是否可与靶标蛋白较强的相互作用方式，如氢键、静电吸引、疏水作用、π-π 堆积和阳离子-π 键相互作用等；是否靶中的小分子化合物的结构有足够的刚性（尤其是蛋白-蛋白互作的 RBD-ACE2 体系），即控制可旋转键的数量。以 COVID-19 病毒靶标 RdRp 蛋白为例，青岛海洋科学与技术试点国家实验室的科研团队在搭建 COVID-19 病毒 RdRp 蛋白三维结构时，也采用晶体结构 3H5Y 和 3OL6 的两个结构辅助，将核酸叠合于COVID-19 病毒的 RdRp 中，并将活性位点的2个 Mn²⁺ 替换成活性更高的 Mg²⁺。核酸末端的碱基，即与 CTP 配对的 G，可以进行突变，将原来的 G 突变成了 U，将 CTP 进行修改替换为 NTP。我们选取一个虚拟筛选函数值最高的化合物：Methyl_lithospermate_B，该化合物与 RdRp 相互作用的整体模式图如图2E所示，而更加清晰直观的微观结合图详见图3。可知，靶标 RdRp 的 NTP 结合口袋整体上偏碱性，有 Arg437, Arg439, Lys505和Lys682 4个碱性氨基酸，而偏酸性的氨基酸如 Asp502, Asp644, Asp645 则与2个 Mg²⁺ 形成强静电（或配位）相互作用。因此，高活性的 RdRp 抑制剂将会是具有多羟基、多羰基等基团，且这些基团还需与2个 Mg²⁺ 形成强静电（或配位）相互作用。化合物 Methyl_lithospermate_B 与蛋白 RdRp 的 Arg437，Lys505 和 Lys682 的侧链形成了3条氢键，与 Asp644 和 Ser698 的侧链也形成了2条氢键，同时与核酸上的 U601 和 A701 也存在多达4条氢键。化合物 Methyl_lithospermate_B 存在三条脂键，其中的2条脂键的羰基和另外1个脂键中的氧原子都与一个 Mg²⁺ 靠近，形成弱静电（诱导偶极产生的）相互作用。此外，化合物 Methyl_lithospermate_B 也是多芳香基团的，可与 Arg439 形成阳离子-π键，与 Pro504 形成了 π-π 堆积相互作用。化合物 Methyl_lithospermate_B 的芳香苯环也伸入到由 Tyr503, Pro504, Lys505 和 Lys682 组成的疏水性口袋中去。可见，化合物 Methyl_lithospermate_B 与蛋白 RdRp 间的结合主要由氢键主导，同时极性静电和非极性（如疏水、阳离子-π键和π-π键）相互作用也起着辅助的作用。
 
图3. 靶标蛋白RdRp与虚拟筛选得到的靶中化合物Methyl_lithospermate_B的相互作用模式

优势与特色
 ◆ 本项目采用的虚拟筛选方法是 sybyl-X2.0 药物设计平台下的 surflex 分子对接模块，该分子对接模块是商业版的方法，其方法的可行性，成功率，操作性，准确度都明显高于常见的免费开源分子对接方法或软件，也常常在准确度方面优于其他商业上的分子对接软件。◆ 本项目采用了三轮筛选过程：第一轮是类药性筛选，第二轮是基于surflex分子对接方法的虚拟筛选，第三轮则由具备多年药筛经验的工程师参与。多轮筛选保证了结果的准确度。◆ 本项目选用了 TargetMol 库中的上市药物分子、临床药物分子等共计15,376个活性化合物作为产品来源，这些化合物均有相应文献证明了它们在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等方向上的已有活性或潜在活性，是药物重定位筛选项目的重要助力。 截止2020-2-26，全国现存新冠感染人数已达45,603人，现存疑似病例2,491人。虽然国内的疑似病例一再下降，严格的防控措施颇有成效，但据外媒报道，日本、韩国的疫情已初见端倪，确诊患者分别达到了862例和1,146例，而当地政府的管控力度广遭诟病。可以预见在未来的很长一段时间里，COVID-19 仍将是全球疾控的热点话题，针对它的药物研发依旧刻不容缓。作为一家专业的药筛平台，陶素愿无偿提供本次虚拟筛选的数据结果。如果您觉得本文对您有所帮助，欢迎分享给您的同行，陶素愿与全球医药研发工作者携手并进，一同为抗击新冠病毒而努力！ 数据结果获取方式：1、发送邮件至info@tsbiochem.com；2、拨打400-821-2233热线。
​​​​​​​*本次筛选所用蛋白结构来自青岛海洋科学与技术试点国家实验室2019-nCoV药物靶标结构信息共享平台系统，感谢该平台的无私奉献。虚筛数据仅代表计算机模拟、计算的结果，未经生物实验验证，仅供参考。