■ 【TargetMol 明星分子】- GSK484 hydrochloride: 精确调控PAD4，揭示中性粒细胞胞外诱捕网与染色质调控的关键节点

■ 1. 背景介绍

GSK484 hydrochloride (TQ0067)，CAS: 1652591-81-5 是一种可逆性的高亲和力肽基精氨酸去亚氨酶4（PAD4）抑制剂。PAD4 依赖 Ca2+ 催化蛋白精氨酸向瓜氨酸的转化，该反应去除精氨酸侧链正电荷，从而重塑蛋白—蛋白与蛋白—DNA 相互作用，显著影响组蛋白构象与染色质可及性。在中性粒细胞中，PAD4 介导的组蛋白高瓜氨酸化驱动染色质去凝聚，是形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的关键步骤，凸显其在先天免疫信号与染色质调控中的枢纽作用[1]。在 PAD 通路中，关键要素包括作为催化核心的 PAD4、作为变构激活因子的胞内 Ca2+，以及核内底物组蛋白 H3/H4；其修饰级联最终改变染色质拓扑并影响转录程序。

GSK484 hydrochloride 对 PAD4 的抑制强度达亚微摩尔水平：在无 2 mM Ca2+ 条件下 IC50 为 50 nM，而在有 2 mM Ca2+ 时为 250 nM，提示 Ca2+ 依赖的构象调控会影响抑制剂亲和力。由于 PAD4 活性受 Ca2+ 门控，这些定量参数为实验设计提供依据，即细胞钙水平与缓冲条件可改变化合物的有效性。其可逆性使得对 PAD4 的阻断具有时间可控性，便于对瓜氨酸化动力学及下游表型进行“开—关”式解析。

在通路调控层面，GSK484 hydrochloride 抑制 PAD4 催化的组蛋白瓜氨酸化，从而限制染色质去凝聚与 NET 生成；与此一致，它在体内外均可抑制 NET 形成，为区分 NETosis 中 PAD4 依赖步骤与上游中性粒细胞激活程序提供了药理学工具[1,2]。在免疫之外，PAD4 通过影响染色质压缩度与转录调控联系到 DNA 损伤应答。在结直肠癌研究模型中，GSK484 hydrochloride 可提高放射敏感性，这与染色质状态影响辐射反应与修复通路参与的认识相一致。

综上，GSK484 hydrochloride 适用于多领域研究：在炎症与血栓生物学中，可用于急性阻断 NET 形成（如检测 H3 瓜氨酸化、MPO–DNA 复合物与胞外 DNA）；在染色质与表观遗传研究中，其选择性 PAD4 抑制可将精氨酸去亚氨基化与其他组蛋白修饰区分开来；在肿瘤模型中，可用于调控 PAD4 相关的染色质程序并检验结直肠癌放射敏感性假设。其明确的 IC50、可逆性与对 NETosis 的控制力，使 GSK484 hydrochloride 成为精确调控 PAD 通路、解析 PAD4 在先天免疫、染色质调控与辐射反应交界处作用的化学探针[1,2]。

■ 2. 文献分享

■ 2.1 Targeting the Toll-Like Receptor 4 Ameliorates Heart Failure in Aged Mice by Inhibiting the Formation of Neutrophil Extracellular Traps.

▲ 使用特异性抑制剂抑制NETs形成。（A–B）ELISA检测衰老HF小鼠经NETs抑制后血清中MPO-DNA和NE-DNA水平；（C–D）免疫荧光染色检测衰老HF小鼠心肌组织中Ly6G与MPO或cit-H3的共定位，箭头指示共定位细胞，标尺=20 μm。n=8，p<0.001。

GSK484 hydrochloride (TQ0067) 在本研究中被用于老年小鼠异丙相关术语诱导的心力衰竭模型，并以腹腔注射方式给药，剂量为4 mg/kg，每日一次，连续7天。研究显示，GSK484 hydrochloride 可降低心肌组织中的中性粒细胞胞外陷阱形成，其证据为血清MPO-DNA与NE-DNA水平均下降，同时心肌组织中Ly6G与MPO或citrullinated histone H3的共定位程度减少。除对中性粒细胞胞外陷阱的抑制外，GSK484 hydrochloride 还改善了心力衰竭结局，包括提升心脏功能、降低血清NT-proBNP与cTnI水平，并减轻心肌组织的病理损伤与胶原沉积。上述结果共同表明，GSK484 hydrochloride 在该老年心力衰竭小鼠模型中同时降低了与中性粒细胞胞外陷阱相关的系统性与心肌局部指标，并带来与心衰相关的功能与结构性指标的改善。[3]

■ 2.2 IL-17A Promotes NETs Formation via the PKCζ-ERK-ROS-PAD4 Pathway in a Mouse Model of Ischemic Stroke

▲  GSK484可减少MCAO小鼠大脑中动脉梗死灶体积并减轻神经功能损伤。（A）建立1 h MCAO/R 24 h小鼠模型，腹腔注射GSK484（4 mg/kg），TTC染色分析脑梗死体积（白色为梗死区域，脑片厚度1 mm）；（B）TTC染色统计图，数据以mean±SEM表示，双因素方差分析，p<0.001 vs. sham组；p<0.001，n=6/组；（C–F）建立1 h MCAO/R小鼠模型，腹腔注射GSK484，分别于术前、术后第3天及第7天检测小鼠神经功能，包括（C）转棒评分、（D）平衡木评分、（E）神经功能评分及（F）Longa评分。数据以四分位数表示，单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni检验，p<0.001，p<0.01，p<0.001，n=10/组。

GSK484 hydrochloride (TQ0067) 作为PAD4抑制剂应用于小鼠大脑中动脉阻断模型后，显著降低了梗死体积，并改善了神经功能学结局；行为与神经学评估显示，转杆、平衡梁、神经功能评分以及Longa评分等多项指标均有提升。分子水平检测与功能改善相一致：Western blot结果表明，GSK484 hydrochloride 使在缺血再灌注后升高的PAD4、MPO与CitH3蛋白水平均下降。免疫荧光分析同样显示，在梗死周围区域，GSK484 hydrochloride 处理后PAD4、MPO与CitH3的表达显著降低。综合上述数据，GSK484 hydrochloride 抑制了PAD4的表达并减少了中性粒细胞胞外诱捕网的形成，体现为NETs相关标志物下调与神经行为学表现改善的协同呈现，提示通过PAD4抑制所带来的对缺血再灌注相关中性粒细胞反应的减弱与功能获益相一致。[4]

■ 2.3 NETosis-Dependent Generation of Immunodeficient Low-Density Neutrophils Exacerbates Sepsis-Induced Acute Lung Injury.

▲  NETs释放与LDN生成的相关性。（A）ELISA检测GSK484干预后上清液中NETs含量；（B）GSK484干预后LDN数量的变化；（C）ELISA检测各组细胞在静息状态及PMA刺激后培养上清中NETs水平；（D）流式细胞术检测各组细胞PI含量；（E）荧光显微镜观察各组DAPI染色结果；（F）扫描电镜观察各组中性粒细胞形态。p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001。

GSK484 hydrochloride (TQ0067) 在本文中被描述为NETosis抑制剂与PAD4抑制剂，并可靶向PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化这一NET形成的关键步骤。于脓毒症小鼠模型中，免疫荧光结果显示GSK484 hydrochloride抑制了肺部NET的形成。与此同时，GSK484 hydrochloride降低了肺组织中低密度中性粒细胞的比例。组织学评估显示，GSK484 hydrochloride给药后与脓毒症相关的肺部病理损伤得到缓解，炎症介质检测亦显示肺组织内IL-1β与TNF-α水平显著下降。体外实验方面，GSK484 hydrochloride显著降低了低密度中性粒细胞的生成；在LPS刺激条件下，原本升高的低密度中性粒细胞比例与上清NET浓度，在加入GSK484 hydrochloride后均明显下降。综合上述证据，研究得出结论：通过NETosis抑制，GSK484 hydrochloride减轻了肺内NET形成与低密度中性粒细胞浸润，从而缓解了脓毒症诱导的急性肺损伤。[5]

■ 2.4 High-throughput chemical proteomics workflow for profiling protein citrullination dynamics.

▲  病原体诱导NETs形成中保守的核心瓜氨酸组。（a）实验流程图：原代人中性粒细胞以热灭活白色念珠菌（HKCA）刺激或血清对照处理3 h（n=4，均来自同一供体的独立样本制备）。MOI：感染复数。（b）静息态（n=3）、血清对照（n=4）及HKCA刺激中性粒细胞（n=4）中瓜氨酸化位点定量统计，圆点表示各生物学重复。（c）HKCA刺激与离子霉素刺激（来自Fig. 4）中性粒细胞中瓜氨酸化位点的重叠情况，交集定义为保守的“核心”瓜氨酸组。（d）HKCA与离子霉素刺激下瓜氨酸化蛋白的重叠分析。（e）共有瓜氨酸化蛋白的GO生物学过程富集分析。（f）Sankey图（左）及条形图（右）展示瓜氨酸化程度最高的蛋白，绿色条表示与离子霉素刺激共有的且表达上调的位点数量，灰色条表示HKCA刺激下检测到的位点。

GSK484 hydrochloride (TQ0067) 被用作选择性抑制剂以探究中性粒细胞中PAD4活性对瓜氨酸化组的影响。在0.3–30 µM范围内，GSK484 hydrochloride 使瓜氨酸化肽段信号强度和位点检出均呈剂量依赖性下降，并在所有条件下共定量到1,568个瓜氨酸化位点。其中特征位点与离子霉素诱导数据集有超过1,100个位点重叠，构成评估抑制剂反应性的共同背景。在这一共享子集中，GSK484 hydrochloride 显著下调了190个位点，从而界定出一个PAD4依赖的瓜氨酸化组；其中有103个位点在离子霉素刺激时上调，说明存在一个在中性粒细胞活化过程中由PAD4直接调控的核心集合。对受调控位点的半最大效应浓度分析表明，GSK484 hydrochloride 的中位EC50约为760 nM。对底物层面的响应显示，GSK484 hydrochloride 作用于经典PAD4靶标，包括组蛋白H3的R17与R26、组蛋白H1.10的R127、R128、R155、R156，以及层粘连蛋白B1的R197、R220、R221、R276。此外，还鉴定到位于参与染色质组织的核内RNA/DNA结合蛋白（如HP1BP3与HNRNPU）上的PAD4依赖位点，进一步体现了PAD4介导的核内瓜氨酸化在中性粒细胞活化中的作用。[6]

■ 2.5 Neutrophil methylmalonic acid promotes microthrombus formation and adverse cardiac remodeling post-myocardial infarction through activating IL-6 signaling pathway-mediated NETosis.

▲ NETs抑制减轻MMA诱导的MI后心功能不全、重塑及血栓形成。（A）实验方案流程图；（B, F）各组MI后第3天梗死周边区NETs代表性免疫荧光图像及定量分析，标尺=20 μm，n=6；（C–D）各组MI后第3天及第14天代表性M型超声心动图图像；（G–J）MI后第14天超声心动图参数定量分析，包括射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左室舒张末期容积（LVEDV）和左室收缩末期容积（LVESV），n=6；（E）各组心脏切片代表性Masson三色染色，标尺=1 mm，n=6；（K, N）各组微血栓形成代表性免疫荧光图像及定量分析，三重免疫荧光显示CD31（红色）、vWF（绿色）和DAPI（蓝色）共定位，标尺=10 μm，n=6；（L–M）血块回缩及血小板聚集代表性图像；（O–P）血块回缩及血小板聚集定量分析，n=6。统计学显著性采用双因素方差分析及事后检验，表示组内比较，#表示组间比较。数据以mean±SD表示，P<0.05，P<0.01，P<0.0001。

GSK484 hydrochloride (TQ0067) 在本研究中作为PAD4抑制剂使用，于心肌梗死诱导前10天开始给药，连续10天每日给予4 mg/kg。给药后，GSK484 hydrochloride 在S100a8 Cre与Mmut CKO两类小鼠中均显著降低了循环NET标志物水平。在心肌梗死后的Mmut CKO小鼠中，由于内源性MMA升高而出现的心肌局部NET形成，被GSK484 hydrochloride 明显减弱。作为研究中评估的NETosis抑制剂之一，GSK484 hydrochloride 伴随在术后第3、7与14天超声心动图所示的心功能显著改善。包含GSK484 hydrochloride 的NET抑制还在术后第14天明显减少了Mmut CKO小鼠的心肌纤维化。免疫荧光结果进一步显示，纳入GSK484 hydrochloride 的NET抑制降低了Mmut CKO小鼠心肌微血栓形成。在离体实验中，来源于Mmut CKO小鼠的骨髓中性粒细胞所表现的增强NET释放，被包含GSK484 hydrochloride 的NETosis抑制所削弱。此外，包含GSK484 hydrochloride 的NETosis抑制减轻了与中性粒细胞内源性MMA相关的促血栓学特征，包括血小板聚集、凝块回缩与血小板黏附。[7]

■ 3. 结语

GSK484 hydrochloride 作为一种可逆性高亲和力的PAD4抑制剂，通过抑制组蛋白及核内蛋白的精氨酸瓜氨酸化，限制染色质去凝聚与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成。文献报道表明，GSK484 hydrochloride 在心力衰竭、缺血性脑卒中、脓毒症急性肺损伤及心肌梗死等多种疾病模型中有效抑制NET形成，改善炎症反应、微血栓形成及组织损伤，提升功能性结局。化学蛋白组学分析揭示其选择性调控中性粒细胞活化过程中的PAD4依赖性瓜氨酸化组。未来研究可利用该化合物深入解析PAD4在先天免疫、表观遗传及辐射反应中的作用，并探索针对NET相关病理的新型治疗策略。

■ 4. Q&A

Q1: GSK484 hydrochloride 的主要靶点及作用机制是什么？

A1: GSK484 hydrochloride 是一种可逆性高亲和力的肽基精氨酸去亚氨酶4（PAD4）抑制剂，PAD4在钙离子依赖下催化组蛋白及核蛋白的精氨酸转化为瓜氨酸，调控染色质结构及中性粒细胞胞外诱捕网形成。

Q2: GSK484 hydrochloride 在哪些疾病模型中表现出治疗效果？

A2: GSK484 hydrochloride 在老年小鼠异丙相关术语诱导的心力衰竭、缺血性脑卒中（大脑中动脉阻断模型）、脓毒症诱导的急性肺损伤及心肌梗死等模型中，有效抑制NET形成，减轻炎症和组织损伤，改善功能结局。

Q3: GSK484 hydrochloride 如何助力表观遗传及蛋白质组学研究？

A3: 通过选择性抑制PAD4，GSK484 hydrochloride 使研究者能够区分PAD4依赖的瓜氨酸化与其他组蛋白修饰，界定中性粒细胞活化过程中的核心PAD4依赖瓜氨酸化组，促进对染色质调控机制的深入理解。

■ 5. 参考文献

[1] Wang Y, Li M, Stadler S, et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 2009;184(2):205-213.

[2] Lewis HD, Liddle J, Coote JE, et al. Inhibition of PAD4 activity and neutrophil extracellular trap formation by a selective small-molecule inhibitor. Sci Rep. 2015;5:15960.

[3] Liu H, Chen X, Wu Z. Targeting the Toll-Like Receptor 4 Ameliorates Heart Failure in Aged Mice by Inhibiting the Formation of Neutrophil Extracellular Traps.. Physiological research. 2026;75(1):29-43.

[4] Liu C, Chen Q, Chen W, Han X, Qiao X, Guo J, Su W, Dai Q. IL-17A Promotes NETs Formation via the PKCζ-ERK-ROS-PAD4 Pathway in a Mouse Model of Ischemic Stroke. CNS Neurosci Ther. 2026 Mar;32(3):e70825.

[5] Sun R, Huang J, Jin H, Wen X, Gao X, Sun B. NETosis-Dependent Generation of Immunodeficient Low-Density Neutrophils Exacerbates Sepsis-Induced Acute Lung Injury.. International journal of molecular sciences. 2026;27(4):.

[6] Meelker González R, Laposchan S, Riedel E, Fürst A, O'Sullivan N, Gabriel W, Wilhelm M, Knolle PA, Médard G, Kuster B, Lee CY. High-throughput chemical proteomics workflow for profiling protein citrullination dynamics. Nat Commun. 2026 Feb 21;17(1):1982.

[7] Liu Y, Wang J, Cai H, Wang Z, Lu R, Liu X, et al.. Neutrophil methylmalonic acid promotes microthrombus formation and adverse cardiac remodeling post-myocardial infarction through activating IL-6 signaling pathway-mediated NETosis.. BMC medicine. 2026;24(1):.